血清纤维黏连蛋白促晚期骨关节炎患者软骨下松质骨祖细胞软骨分化

【摘要】目的：探索晚期骨软骨炎(osteoarthritis,OA)患者膝关节软骨下松质骨内是否具有成软骨分化能力的祖细胞,并对其“间充质干细胞”性质进行验证;研究血清游离纤维黏连蛋白(fibronectin,Fn)及骨形态发生蛋白-2(bonemorphogeneticprotein-2,BMP-2)对该细胞体外成软骨诱导分化的影响。方法：通过“贴壁法”从13例因OA行膝关节置换术患者术中软骨下松质骨标本中分离获得软骨下松质骨祖细胞,经体外培养扩增后采用流式细胞检测技术对其细胞表面抗原进行分析；并进行体外成骨、成脂、成软骨诱导分化培养,通过组织染色和免疫组织化学染色及Real-TimePCR检测对其多方向分化潜能进行验证；用一定浓度血清游离Fn、BMP-2分别及共同作用干预该细胞体外成软骨诱导分化过程,即将细胞分为阴性诱导组、阳性诱导组、25ug/ml血清游离Fn诱导组、100ng/mlBMP-2诱导组、25ug/ml血清游离Fn与100ng/mlBMP-2共同干预诱导组,诱导完成后通过免疫组织化学染色和Real-TimePCR分别定性和半定量对比干预诱导组、单纯诱导组及阴性对照组成软骨分化相关基因CollageⅡ、Aggrecan、SOX-9及CollagenⅠ基因的表达水平。结果：无菌状态下获得的骨块经体外培养4-7天后,细胞开始迁移至培养瓶,细胞形态大体呈梭性,贴壁生长,体外增殖5代内细胞形态未见明显改变；流式细胞检测示该细胞表面抗原不表达CD14(0.24%),CD19(0.96%),CD34(0.47%),CD45(0.95%),HLD-DR(0.21%),高表达CD44(98.69%),CD73(97.94%),CD90(99.88%),CD166(91.46%),且CD105(6.13%),CD146(10.41%)亦呈阳性,基本符合间充质干细胞细胞表面抗原特性；经体外成骨、成脂肪、成软骨诱导培养后,茜素红染色、碱性磷酸酶活性检测表明该细胞具有体外成骨分化能力,油红0染色验证其具有体外成脂肪分化能力,阿利新蓝染色、CollagenⅡ及aggrecan免疫组化提示该细胞具有体外成软骨分化能力。分组诱导完成后,免疫组化染色显示阴性对照组Ⅰ型胶原染色阳性,而Ⅱ型胶原和Aggrecan免疫组化染色为阴性：阳性对照组三者均为阳性,但Ⅰ型胶原的表达要弱于阴性对照组；Fn组、BMP组及Co组亦有类似阳性对照组表达,其中Fn组Aggrecan、Ⅱ型胶原的表达最为明显,Ⅰ型胶原表达下降最为明显。Real-TimePCR检测提示所有诱导组成软骨分化相关基因CollagenⅡ、Aggrecan、SOX-9mRNA表达水平明显高于未诱导组,CollagenⅠ基因表达下降；25ug/ml浓度血清游离Fn诱导组成软骨分化相关基因CollagenⅡ、Aggrecan、SOX-9mRNA表达水平明显高于单纯成软骨诱导组,且高于100ng/mlBMP-2诱导组,CollagenⅠ表达水平下降亦较单纯成软骨诱导组和BMP-2组明显,以上数据差异均具有统计学意义。而Fn及BMP-2共同干预组CollagenⅡ、Aggrecan、CollagenⅠ的基因表达水平与单纯Fn干预组相比未见显著性差异,显示Fn与BMP-2共同干预未显示对晚期OA患者膝关节软骨下松质骨祖细胞成软骨分化有进一步的促进作用。结论：晚期OA患者膝关节软骨下松质骨内存在具有“间充质干细胞”性质的祖细胞,在体外具有良好的成软骨分化潜能；一定浓度的血清游离纤维黏连蛋白具有良好的促进该细胞体外成软骨诱导分化；BMP-2联合干预可能不会进一步提高血清游离Fn促进该细胞体外成软骨分化诱导能力。
【作者】蒋超；
【导师】王以朋；
【作者基本信息】北京协和医学院，临床医学，2014，博士
【关键词】骨关节炎；间充质干细胞；软骨下骨祖细胞；成软骨分化；血清游离纤维黏连蛋白；

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